研究内容简介
抗菌寡聚物AAOG的设计、合成以及作用机制。
抗菌肽（AMPs）和AMP模拟物通常依靠两亲结构引起磷脂膜的物理性损伤来杀死细菌，这是它们对抗耐药菌的能力和与其细胞毒性的根源。这种两亲结构的空间分布形式对其性质有着很大的影响，例如最常见的面式两亲(Facialamphiphilicity)结构对哺乳动物细胞的膜破坏力也较强，易引起真核细胞毒性。面式两亲结构暴露在外的疏水面也可能会导致与蛋白质的非特异性结合和聚集，导致化合物产生细胞毒性并降低其抗菌活性。有研究表明，螺旋多肽可以产生径向两亲(Radialamphiphilicity)结构，具有高抗菌活性和高的膜选择性，并且与传统抗生素具有优异的协同作用。那么，是否可以构建其他类型的两亲性分布形态，进一步提升破膜选择性，提高抗菌高分子的性能呢？
白玉罡与冯欣欣课题组在年初报道了一种新型的、具有DNA/膜双重靶向机理的寡聚脒类抗菌化合物，利用双重机理来降低了杀菌能力对破膜能力的依赖性，从而提高了化合物对原核/真核细胞的选择性，增大治疗指数。在本文的工作中，他们与深圳湾实验室王英杰副研究员合作，共同设计了具有空间交替两亲结构(AlternatinglyAmphiphilic)的聚脒类化合物。根据计算化学分析，该寡聚物不仅在结构上存在交替出现的亲疏水基团，更在溶液中可以呈现出杆状的交替两亲构象，这令阳离子基团（胍基）和疏水部分在空间上线性排列，避免聚集，促进了其与核酸和细菌细胞膜的结合。因此，构建这种新型的交替两亲结构低聚物不仅能够保持甚至增强DNA结合的第二重抗菌机理，还能进一步提升化合物在膜机理抗菌方面的选择性，从两方面共同提升双机理抗菌化合物的杀菌效果。
抗菌寡聚物AAOG的合成路线以及计算模拟结果。
研究团队利用异硫脲单体和对苯二甲胺缩聚合成了聚胍类寡聚物AAOG，同时还制备了结构柔性较大的对照寡聚物CTOG。通过计算模拟可以看到聚胍类寡聚物AAOG具有交替两亲结构，其内部刚性结构使得亲疏水部分交替展开。而对照寡聚物CTOG在溶液中会发生链内自组装，不具备交替两亲的结构特点。溶血实验结果表明，AAOG具有很低的溶血活性，而CTOG则相反，这表明了交替两亲型结构在膜选择性上的重要性。初步的抗菌能力测试也表明，寡聚物AAOG能够有效抑制大多数病原菌和耐药性菌株的生长，杀菌动力学显示AAOG具有很快的杀菌速率，由此确定了寡聚物AAOG优异的体外抗菌活性。
(a)AAOG对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌的杀菌动力学；(b)AAOG在大肠杆菌中产生ROS而在细胞中不产生；(c)AAOG处理大肠杆菌后表面Zeta点位变化；(d)AAOG引起大肠杆菌膜破裂逆转了对DiSC3(5)染料的猝灭作用；(e)PI染料指示的AAOG选择性破坏细菌外膜示意图；(f)AAOG选择性破坏细菌外膜；(g)AAOG的进入细胞的进胞机理；(h)AAOG分别处理金黄色葡萄球菌、大肠杆菌后SEM图像。
研究团队继续研究了寡聚物AAOG的抗菌机理，验证了AAOG的交替两亲结构设计低毒高效的性质。通过扫描电镜、流式细胞术、进胞机理等一系列实验，研究团队确定了寡聚物AAOG可以选择性地破坏细菌的细胞膜而对细胞的细胞膜伤害很低。DNA拯救实验、荧光竞争实验和寡聚物在细菌、细胞内的分布实验表明AAOG可以结合细菌内的DNA而不影响哺乳动物细胞内的DNA，证明了AAOG也存在结合细菌DNA的第二重抗菌机理。在探究ROS引发的实验中，发现AAOG在一定的浓度下可以引起细菌产生ROS，而在相同的浓度下不会引起哺乳动物细胞产生ROS，进一步证明了AAOG对于细胞的安全性。
(a)AAOG荧光竞争实验；(b)外源添加DNA抑制AAOG活性；(c)AAOG在大肠杆菌中分布的共聚焦显微镜图像；(d)AAOG在NIH/3T3细胞中分布的共聚焦显微镜图像。(e)AAOG不同浓度下的溶血活性；(f)细菌-哺乳动物细胞共培养模型示意图；(g)AAOG在共培养模型中拯救了NIH/3T3细胞，杀死了所有金黄色葡萄球菌，而没有引起对哺乳动物细胞的细胞毒性。
(a)抗生素分类与致敏程度之间无显着相关性；(b)AAOG分别和四环素，强力霉素，纳地沙星以及洗必泰对于鲍曼不动杆菌的棋盘敏化实验结果；(c)AAOG和洗必太对于鲍曼不动杆菌临床耐药株的棋盘敏化实验结果；(d)AAOG和纳地沙星对于肺炎克雷伯菌QXM1的棋盘敏化实验结果。
在细菌细胞共培养模型中，寡聚物AAOG能够有效杀灭共培养模型中的细菌，保护细胞不受伤害。得益于寡聚物AAOG不破坏真核细胞细胞膜、不进入真核细胞的核结合DNA的性质，它可以杀死细菌而几乎不伤害细胞。在联合用药敏化抗生素方面，经过敏化筛选实验，寡聚物AAOG能够协同敏化抗生素纳地沙星、四环素和强力霉素，增强这些抗生素的杀菌能力，此外对抗菌剂洗必泰也有很好的协同敏化作用。抗菌聚合物在抗菌方面的一个重要优势就是难以产生耐药性，耐药性进化实验表明AAOG几乎不能令细菌产生耐药性，而卡那霉素和氨苄西林均在同样条件下均产生了程度不等的耐药性。
(a)AAOG、卡那霉素和氨苄青霉素的耐药性进化实验；(b)AAOG对线虫的生物相容性测试；(c)AAOG和氨苄青霉素对金黄色葡萄球菌感染的线虫的抗菌效果比较；(d)AAOG在小鼠切除伤口模型研究中治疗效果；(e)第2天量化存活小鼠伤口区域的细菌数量；(f)存活小鼠的伤口区域H＆E染色分析。
在随后的动物实验中，研究团队用线虫和小鼠建立了几种不同的模型。在线虫细菌感染模型中，AAOG在24小时内清除干净了线虫体内的金黄色葡萄球菌，而对照抗生素氨苄西林不能完全杀灭线虫体内的金黄色葡萄球菌。在严重表面创伤小鼠模型中，AAOG可以显著提高感染小鼠的存活率，远远优于抗生素美罗培南的效果。在治疗过程中寡聚物AAOG未对线虫或者老鼠机体产生明显的毒性。这些活体实验的结果有力表明了AAOG在治疗耐药性感染方面的潜力。
本论文的三位共同第一作者为湖南大学化学生物学与纳米医学研究所（ICBN）的博士生陈智勇、硕士生周彩玲和徐扬帆。湖南大学化学化工学院的白玉罡教授、冯欣欣副教授以及深圳湾实验室的王英杰副研究员为本文章的共同通讯作者。
课题组简介湖南大学化学化工学院白玉罡课题组：白玉罡教授课题组的研究主要立足于有机化学和高分子化学，力图使用有机化学和高分子化学的方法与理念在化学生物学方向寻求新的方法学设计与应用。课题组的主要研究方向为：（1）具有新颖化学结构和拓扑结构的有机大分子材料的合成方法学研究与其在化学生物学、医学方面的应用；（2）细胞内非天然反应的原位催化方法学与应用研究，主要寻求在高分子仿酶催化剂和人工金属酶的设计、合成方面的突破。课题组希望借助合成或天然高分子作为平台，通过结构设计和可控合成（表达），获取具有精密结构的功能化高分子。通过在合成或天然高分子上引入已知的功能性基团如电荷、氢键给体/受体、生物大分子配体、过渡金属配体等，可以实现特殊的结构、功能设计或引发基团间的协同作用等，强化这些功能性基团的作用，从而令整个体系具有更佳的应用潜力。生物体是一个极其复杂的体系，我们的研究理念是“复杂体系的问题需要复杂体系来解决”。而大分子结构正是构筑可以应用于化学生物学和医学之中的复杂体系的必经之路。
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