摘要
土壤是抗生素抗性基因(ARGs)的重要储存库，但其在不同生态系统中的潜在风险以及对人为土地利用变化的响应尚不清楚。本研究使用宏基因组学方法和具有良好特征的宏基因组数据的数据集，分别调查了阿拉斯加冻土带、美国中西部草原和亚马逊雨林三个自然生态系统土壤DNA中ARGs的类型和数量，以及后两者转化为农牧业的效果。
不同生态系统均表现出高度的多样性(个ARG亚型)和丰富性(每16SrRNA基因拷贝数为0.-0.个ARG拷贝)，多药耐药性和外排是主要类型和机制。共鉴定出10个调控基因，它们占土壤抗性丰度的13%~35%，其中arlR、cpxR、ompR、vanR和Vans为优势基因，在所有供试土壤中均可观察到。鉴定了三个生态系统的全部26个土壤宏基因组共有的55个非调控ARGs，它们占非调控抗性组丰度的81%以上。变形菌门、厚壁菌门和放线菌门是ARGs的主要宿主，10种最丰富的ARGs中有7种在它们中发现。本地草原土壤和邻近长期耕作农业土壤的ARG多样性和丰度没有显著差异。选择了12个临床上重要的ARGs在序列水平上进行评估，发现它们与人类病原体中的ARGs不同，当组装后，它们甚至更不相似。细菌群落结构与耐药组图谱之间存在显著的相关性，说明耐药组图谱的变异主要受细菌群落组成的影响。
材料和方法
样本：26份土壤样本：阿拉斯加冻土带、美国高草草原生态系统、亚马逊热带雨林
测序：IlluminaHiSeqPE测序
分析：ARGs鉴定、ARGs宿主分类、临床ARGs的鉴定、土壤细菌群落分析、统计分析
主要结果
1检测到的ARGs和调控基因
在土壤中共检测到种可能对21类抗生素产生抗药性的ARG亚型，其中大部分属于抗生素失活机制(个ARGs)和外排泵机制(93个ARGs)(图1)。超过58%的抗性组丰度是由外排泵基因贡献的，而只有16%来自失活和细胞保护类。共检测到10个调控基因(mtrR、gadX、TetR、mext、cAMP调节蛋白、arlR、ompR、vanS、cpxR、vanR)，占所研究土壤抗性组丰度的13%~35%。5个调控基因为显性基因，总拷贝数为0.-0.拷贝/16SrRNA基因拷贝，在所有26种土壤中均可观察到。多药耐药基因最丰富(占非调节性耐药组丰度的57.1%)，共有67个亚型，其次是MLS类抗生素耐药基因，有28个亚型，占非调节性耐药组丰度的11.2%(图1B)。在这些土壤中检测到71个β-内酰胺类、24个四环素类和20个氨基糖苷类抗性基因亚型，但它们平均只占非调节性抗性基因丰度的2.6%、3.0%和1.6%。
图1.26个土壤宏基因组中ARGs和调控基因的组成
A：抵抗机制；B：抗生素类别。
2
所有土壤共有的非调节ARGs
所有26个土壤共有55个非调控ARGs(图2A)。这些共有的ARGs占所有土壤中非调节性抗性丰度的81.5%到98.6%。共有的ARG由9类抗生素耐药组成，但大多数为多药耐药基因(31个亚型，每16SrRNA基因拷贝1.7×10?2~6.7×10?1拷贝)。所有土壤共有6个四环素抗性基因和5个万古霉素抗性基因，它们的抗药性丰度为1.0×10?3~1.2×10?2。在所有土壤中只发现2个β-内酰胺类抗药性基因，丰度为4.6×10?4~3.8×10?3拷贝/16SrRNA。3个生态系统共有的氨基糖苷类和甲氧苄啶抗性基因的浓聚物差异较大，每16SrRNA基因拷贝数在9.4×10-5rRNA~2.0×10-3rRNA拷贝之间。外排泵是这55个共有ARG的主要机制，占共有ARG总丰度的80.6%。
图2.三个生态系统土壤中ARGs的多样性和丰富度
A：热图显示了26个土壤宏基因组中55个背景ARGs的丰度；B：不同机制对ARGs多样性和丰度的影响；C：不同抗生素种类的ARG丰度。
3
宏基因组组装结果中ARG宿主的鉴定
土壤的宏基因组组装数据中鉴定出77-个含ARG的contigs，N50在~14bp。大约81.5%的contigs的ARG覆盖率低于30%，只有4条contigs包含完整的ARG(1个catB，1个dfrB2和3个cAMP调节蛋白)。59个ARG亚型中，20个为多药耐药基因，7个为万古霉素耐药基因，6个为β-内酰胺类耐药基因，5个为四环素耐药基因(图3)。变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和酸杆菌门是ARG的主要宿主，它们分别携带28、21、11和9个ARGs。BacA、mdtB、mdtC和多药转运蛋白基因宿主范围最广(≥4)。调控基因vanR和Vans被归入变形菌门、放线菌门、厚壁菌门。
图3.显示了门水平已识别ARG宿主网络。不同的颜色表示不同类别的ARGs。
总结
研究发现，土壤中的ARGs库是全球性的、巨大的，并表现出显著的地理格局。我们鉴定55个结构性ARGs和5个调节性ARGs在这些不同生态系统的所有样本中都是常见的，并建议将这些候选背景ARGs作为健康风险评估的单独类别。此外，土壤ARGs与人类病原体中常见的ARGs序列相似性较低。作者建议更多地