背景：
II型聚酮化合物属于结构多样的天然产物家族，它们具有多种生物活性，与人体微生物组密切相关。四环素类作为一类必不可少的II型聚酮化合物，临床上用于治疗多种感染。在四环素(TC)、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)和SF等细菌四环素的生物合成过程中，相同的中间体2,4-酮基-脱水四环素(ATC)可以通过各种修饰酶进一步修饰以获得不同的四环素(图1a和图S1a)。尽管如此，D环的α,β-不饱和酮通常保留在最终产物中，除了aureolicacid化合物，包括mithramycin，其骨架是通过通过Baeyer-Villiger氧化裂解四环素前体的D环形成的(图S1b)。
在最近的一项研究中，我们激活并表征了Streptomycesaureusszhoueusis中的一个沉默基因簇tjh，该基因簇控制着两种类型的II型聚酮化合物(五环和四环结构)的生物合成。与包含α,β-不饱和酮的典型四环素相比，这些非经典四环素的D环高度还原为C=C(5-7)或C-C键(9-11)(图1a)。考虑到先前已在ΔtjhO5突变体中鉴定出具有类似于4-羟基-ATC核心结构的三种新化合物(12-14)，非典型四环素很可能由具有α,β-不饱和酮的中间体转化而来(图1a和图S1a)。直观地，D-环中烯酮向烷烃的转化可分为两个子过程，包括C=C键的还原和C=O向CH2的转化。在有机合成中将酮还原为烷烃的策略已得到广泛发展，主要包括Wolff-Kishner-Huang还原、Clemmensen还原和Caglioti还原(图1b)。相应地，这种在自然界中的转化主要发生在I型聚酮化合物的生物合成中，它是通过I型聚酮化合物合酶(PKS)的三个酶结构域实现的，包括酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)和烯酰还原酶(ER)(图1c)。本项研究发现醌氧化还原酶TjhO5可以在体外介导C=O到CH2的这种持续还原反应，涉及一种独特的脱氧机制。此外，TjhO5与NADH依赖的差向异构酶TjhD4一起完成了四环素D环中烯酮向烷烃的转化。值得注意的是，该过程经过两种不同的生物合成途径，在同位素标记实验的基础上，涉及不同的中间体和酶促机制。
结论：
①TjhO5生化特性及产物鉴定
BLAST分析表明，TjhO5属于中链还原酶(MDR)超家族和NADPH:醌氧化还原酶亚家族;它与GrhO7(该酶在griseorhodin生物合成的作用没有被指示)有很高的相似性(50%的同一性)，由于12-14可以自发地去糖基化，而8(具有完全还原的D环)可以在ΔtjhB3(tjhB3编码糖基转移酶)中检测到，去糖基化化合物15应该更可靠，更适合进一步的研究。通过用盐酸水解ΔtjhO5发酵液生成了大量的15，并通过核磁共振波谱数据分析确认了其结构(图S21-S25)。HPLC分析15的保留时间(RT)与双敲除突变体ΔtjhO5/ΔtjhB3粗提物中去糖基化化合物的保留时间相同(图S2和S3)。为了明确其体外功能，从大肠杆菌BL21(DE3)中纯化TjhO5(图S4)。与对照不同的是，在含有NADPH、底物15和TjhO5的反应混合物中LC-MS出现了两个新的峰，其m/z值([M-H]?)与目标产物4一致。令人惊讶的是，这两个峰的RTs与野生型(WT)产生的主要核心结构4的RTs不同(图2a)。
为了研究TjhO5催化的反应，主要产物16通过TjhO5的大规模酶法纯化。化合物16的结构经1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC和NOESYNMR确证(图S26-S31)。化合物16的结构与15相似，不同的是它的C-10羰基被还原为CH2，而16的C-7是R构型而不是15的S构型(图2b)。通过对15和16的1HNMR数据中H-7和H-6a耦合常数的评价可以看出这些差异，分别为11.1和1.6Hz(图2c,d)。此外，在NOESYNMR谱中，16中的H-7与Hβ-6相关，15中的H-7与Hα-6相关(图S5)。同时，由于产量低且不稳定，没有得到一个小产品(图2a中有星号)。
②高度还原修饰的体外重建
在这个阶段，很明显其他的酶应该参与进一步的转化，从α，β-不饱和酮中间产物开始生成最终产物。除tjhO5外，基因敲除实验验证了三个基因tjhC5、tjhD2、tjhD4与四环素后修饰密切相关。通过生信分析，TjhC5包含一个环化酶结构域，TjhD2是一种醛酮还原酶，TjhD5是一种环化酶。与能够还原2,4-酮-ATCC-4羰基的SsfF具有中度同源性(33%氨基酸同源性)，TjhD4属于短链脱氢酶(SDR)超家族和很可能参与后续还原NAD+依赖的异构酶/脱氢酶亚家族。
为了验证这一假设，对来自大肠杆菌BL21(DE3)的TjhD4进行了各种生化检测(图S4)。当中间体16与TjhD4和NADH或NADPH共反应10min，对产物进行LC-MS检测到两个m/z值相同([M-H]?)的新产物。经鉴定主要产物为8，另一个为新化合物17(图3a(i-iii))。17的化学结构经核磁分析(图S32-S37)，其C-9为R构型，而不是8的S构型(图3b)。事实上，在WT的发酵液中可以检测到17，但之前由于滴度低而被忽略。虽然TjhD4可以在体外将16转化为8和17，但都是WT产生的小骨架，不能进一步转化为主要骨架4。同时TjhO5的提取物作为TjhD4的底物不能产生4，说明TjhD4不能将TjhO5的产物转化为4(图S6)。
意外的是，15与TjhO5和TjhD4同时反应产生微量的4。此外，在过量底物15的条件下，将TjhO5与TjhD4的比例从3:1调整为1:3，可以显著提高4的产率(图3a(v-vii))。因此，4的生成需要两种酶的最佳比例，因为过量的TjhO5可能会将4转化为8和17(图3b)。正如预期的那样，TjhO5、4和NADPH的反应导致8和17的出现和4的同时消失(图3a(x,xi))。这些结果表明,(i)TjhO5或TjhD4对于转换α,β不饱和酮底物15到4,8和17是必不可少的,(ii)多功能酶TjhO5不仅可以减少酮到CH2的还原，也可在C7位异构还可以还原不同的官能团，包括C=O和C=C，(3)TjhD4是一个双功能酶可以催化同时差向异构化作用和还原反应，(iv)8和17的形成从15开始通过两种不同的生物合成途径(路径A和B)分别出现在逐步和一锅反应，经历了两个不同的中间体(图3b)。
③两种不同途径的酶学机制的阐明
为了深入分析TjhO5酶促反应的机理，在(R)-[4-2H]-NADPH的存在下，从嗜酸热原体ThermoplasmaacidophilumATCC(TaGDH)中生成葡萄糖脱氢酶(GDH)，重组TjhO5的活性，使用d-[1-2H]-葡萄糖作为氘供体。TaGDH/TjhO5偶联试验检测到+2Da在m/z处的质量位移(图S7)。通过大规模的酶促反应制备2H-16,2HNMR显示，在C-10处，16中包含两个氘(δ(2H)2.48,2.70)(图4a,b)。同时，采用相同的氘供体，在(S)-[4-2H]-NADPH的存在下，对TjhD4进行酶学分析。BmGDH/TjhD4偶联试验可产生两种化合物，均显示+1Da的质量增量(图S8)。
为了确定氘的位置，使用底物15进行BmGDH/TjhO5/TjhD4检测。分离得到的2H-4、2H-8和2H-17的核磁谱图显示，H-8被一个氘取代(图4c和图S9、S10和S45-S50)。结果表明，TjhO5在C-10处还原15两次，在C-8处还原1一次。
鉴于在路径A中TjhO5控制的反应中C-7的构型被逆转，有两种可能的催化机制生成16。TjhO5首先将C-10的羰基还原为羟基，得到化合物18(图S11a)。在其中一种假设中，18被脱水和互变异构形成中间体20，通过1,4加成可以转化为16。或者，19可以被还原为中间产物21，然后经过4次烯醇间转化生成16。为了证实其机理，首先在D2O中引入酶促反应。16的质量数据没有像LC-MS显示的那样发生变化，说明反应并没有将水中的质子提取到C-7中(图S11b)。因此，这些机制需要结合溶剂质子的引入生成产物不成立。由于β羟基-α,β-enone的羰基氧很容易与水交换氧气，15和HO反应只导致大规模增加+2,+4Da。说明15的C-10和C-13中的氧都可以与HO交换(图S12)。TjhO5在HO中催化反应完成后，产物16**的分子量也增加了+2和+4。然后从溶剂中提取16**，在HO中重新平衡过夜，之后仍然观察到16*MW的+2增加(图5和图S13)。此外，16**与15**的MW同位素相对丰度相似(表S7)。这些结果表明，底物C-10处的氧被保留在产物中，并且最有可能迁移到C-7。
为了进一步探索这两种途径的酶促机制，在HO中完成TjhO5反应后，直接加入TjhD4，获得8**和17**，其MW仍增加了2和4Da(图5和图S14)。然而，在HO中同时反应TjhO5、TjhD4、NADPH和15时，检测到所有产物的分子量(4*、8*和17*)仅增加了一个+2，表明A和B途径涉及不同的酶促机制(图3b、5和图S14)。此外，LC-MS显示，D2O一锅反应中，8和17的MW增加了1Da，而4的MW没有明显变化(图S15)。这些结果证实了4的形成不需要氧气转移，也不需要从水提取质子到碳。因此，在TjhD4和TjhO5共反应过程中，TjhD4提供的H-迅速攻击18得到4(图S15)，TjhO5进一步还原18得到8和17。
讨论：本文成功地重组由TjhO5和TjhD4体外重建四环素D环的高度还原修饰，涉及两种不同的生物合成途径和不同的酶机制(图6),在路径A中，TjhO5在C-10两次还原羰基产生16，其可被TjhD4异构和还原形成8和17。由于短键长的C转化为CH2通常需要多步还原和脱氧，因此至少需要两种酶才能实现这一转化。一种还原酶负责这种转化的报道很少。更有趣的是，本研究中表征的C-10脱氧在本质上不同于KstA10催化的kosinostatin生物合成脱水，apramycin,IPP，DMAPP的生物合成的自由基机制以及PMP依赖的酶SpnQ引导的α-羰基介导的d-forosamine生物合成机制(图S16a-d)。TjhO5可以通过氧转移机制去除C-10的一个羟基，并伴随羟基异构化。鉴于TjhO5介导的反应具有较高的立体选择性，且在酸性条件下反应效率显著提高(图S17)，这让人联想到platensimycin生物合成中酸介导的环醚形成。因此，由于酸残基和环境的作用，可能是通过生成潜在的环醚中间体22来实现脱氧(图6和图S18)。根据16中C-7的构型反转和分子模拟，最可能的机理是OH-10的SN2亲核攻击导致22的生成，22可以迅速还原为16(图S18)。此外，TjhD4属于依赖NADH的异构酶，通常参与脱氧糖的生物合成，利用α-羰基的烯醇互转化实现异构化(图S16e)。尽管同源酶的催化机制已经阐明，该酶能在II型聚酮的主链上进行还原和异构化尚未见报道。
在路径B中，第一步需要两种酶协同工作。TjhO5还原C-10的羰基后,TjhD4迅速催化在18的C8位H-的攻击导致羟基的消失产生4,再次由TjhO5还原到8和17(图6)。TjhO5可能出现在这个途径跳过的催化模式而不是连续催化模式路径A。因此，TjhO5和TjhD4在这两种途径中都表现出高的催化混杂型。
对TjhO5的序列相似性网络(SSN)分析显示，与TjhO5密切相关的基团与大多数醌类氧化还原酶的基团不同(图S19)。更具体地说，与TjhO5具有高同源性的蛋白广泛参与II型多酮的生物合成，如GrhO7、MsnO9和HrsP2，这些蛋白分别和griseorhodin,mensacarcin和hiroshidine的生物合成有关。虽然醌氧化还原酶通常参与II型聚酮的生物合成，但大多数这些蛋白质的功能仍有待完全确定。本研究为这些酶的功能鉴定奠定了基础。
结论：总之，本文发现了两种酶，它们可以通过两种不同的途径和不同的酶机制共同将含α，β不饱和酮的D环还原为饱和的D环。本研究揭示了还原酶的活性多样性，揭示了醌氧化还原酶和异构酶在II型多酮生物合成中的作用，可用于基因组挖掘、生物催化和组合生物合成。
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